Определение резус-фактора цоликлонами
Первичное определение резус-фактора цоликлонами Анти-D-Супер (Анти-D IgM) осуществляется в реакции прямой агглютинации. Реагент представляет собой моноклональные IgM антитела человека. Агглютинирует эритроциты с антигеном D, ослабленным Du и частичными вариантами DI - DV, DVII. Положительный результат проявляется в образовании явно различимых агглютинатов и просветлении поля реакции. Не вызывает агглютинацию D-отрицательных эритроцитов и кровяных телец с антигеном DVI.
В случае первичного отрицательного результата у доноров на втором этапе исследования проводят выявление DVI с использованием цоликлона Анти-D в реакции конглютинации с желатином или в непрямом тесте Кумбса. Для реципиентов дополнительный анализ с анти-D IgG антителами не осуществляется.
Исследуемые образцы
Нативная кровь, стабилизированная консервантами; кровь без антикоагулянта, в том числе взятая из пальца. Образцы хранятся до 3 суток при 2 – 8 °С.
Приводим пошаговый алгоритм определение резус-фактора на пластинке, технику проведения исследования в круглодонной пробирке и в планшете. Перед началом тестирования обеспечьте яркое освещение и температуру воздуха в помещении 18 – 25 °С.
Типирование на плоскости
- Промаркируйте пластину: укажите ФИО пациента и название реагента.
- Нанесите на плоскость одну каплю (приблизительно 0,1 мл) реагента Анти-Д-Супер.
- Рядом поместите одну маленькую каплю (0,01 – 0,05 мл) эритроцитов.
- Чистой стеклянной или пластмассовой палочкой смешайте две капли.
- Подождите 10 – 15 секунд.
- Плавно покачивайте пластинку на протяжении 20 – 30 секунд.
- Оцените результат через 3 минуты.
Обычно характерная крупнолепестковая гемагглютинация наблюдается спустя 30 – 60 секунд, но при наличии антигена Du время реакции увеличивается. Подогревание пластины до 37 °С увеличивает скорость реакции.
Техника определения в пробирке
- Подготовьте 5 % взвесь отмытых эритроцитов в физрастворе.
- Добавьте в пробирку 0,1 мл цоликлона Анти-D-Супер (Анти-D IgM) и одну каплю эритроцитов.
- Перемешайте содержимое.
- Инкубируйте пробирку на протяжении получаса. Скорость реакции увеличивается при подогреве пробирки до 37 °С с использованием водяной бани или термостата.
- Центрифугируйте пробирку со скоростью 1500 — 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре на протяжении полминуты.
- Слегка встряхните пробирку для отделения осадка от дна.
- Визуально оцените наличие агглютинации. При обнаружении антигена D образуются один или несколько явно различимых агглютинатов на фоне прозрачного раствора NaCl. В противном случае осадок легко разбивается и является непрозрачной гомогенной взвесью.
Алгоритм определения в планшете
- Внесите в лунку планшета 50 – 100 мкл реагента.
- Добавьте 50 мкл 5 % взвеси эритроцитов в растворе NaCl.
- Перемешайте пипетированием.
- Инкубируйте при температуре 18 – 25 °С один час.
- Проведите визуальную оценку осадка эритроцитов на дне лунки. В случае положительного результата RhD-типирования агглютинаты с неровными четко очерченными краями равномерно выстилают дно. При отсутствии антигена D наблюдается осадок в виде точки.
- Постановление Правительства Российской Федерации от 04.07.2020 № 986 «Об отмене отдельных актов федеральных органов исполнительной власти, признании не действующими на территории Российской Федерации отдельных актов и иных документов Министерства здравоохранения РСФСР и признании не действующими на территории Российской Федерации отдельных актов и иных документов Министерства здравоохранения СССР, содержащих обязательные требования, соблюдение которых оценивается при осуществлении государственного контроля за обеспечением безопасности донорской крови и ее компонентов»;
- Постановление Правительства Российской Федерации от 22.06.2019 № 797 «Об утверждении Правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов и о признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации»;
- Приказ Минздрава России от 20.10.2020 г. № 1134н «Об утверждении порядка медицинского обследования реципиента, проведения проб на индивидуальную совместимость, включая биологическую пробу, при трансфузии донорской крови и (или) ее компонентов»;
- Приказ Минздрава России от 28.10.2020 г. № 1166н «Об утверждении порядка прохождения донорами медицинского обследования и перечня медицинских противопоказаний (временных и постоянных) для сдачи крови и (или) ее компонентов и сроков отвода, которому подлежит лицо при наличии временных медицинских показаний, от донорства крови и (или) ее компонентов».
- Рагимов, А.А. Трансфузионная иммунология/А.А. Рагимов, Н.Г. Дашкова. — М.: Медицинское информационное агентство, 2004. — 279 с.
- Шевченко, Ю.Л. Безопасное переливание крови/Ю.Л. Шевченко, Е.Б. Жибурт. — СПб.: Питер, 2000. — 308 с.